Determinació de proteïnes.2

Procediment

Preparació dels reactius

• Dissolució de NaOH al 40%: Mesurem amb un bas de precipitats 50g de 1 M i els dissolem a 125mL H2O desionitzada.
• Dissolució H2NO4: introduir en un petit bas de precipitats 20mL H2NO4.
• Dissolució de Cu2SO3 1%: mesurar amb una naveta 0,25 g de Cu2SO3, introduir en un erlenmeyer i pipetejar 25mL de aigua desionitzada.
• Dissolució HCl 20%: mesurar 6,4mL amb una pipeta graduada i abocar a un erlenmeyer, pipetejar 25,6mL d'aigua desionitzada.
• Abocar en un bas de precipitats uns 50mL d'aigua i introduir NaCl fins a la saturació de la dissolució.

Dissolució de les mostres

• Etiqueta el bas de precipitat amb el nom de la mostra o blanc

• Pipetejar 2mL de la mostra/blanc i abocar en el bas.
• Mesurar 98mL d'aigua desionitzada en una proveta i abocar en el bas de precipitat.
• Remenar amb una vareta de vidre.

Execució de les proves

Reacció xantoproteïca

• S'etiqueten quatre tubs d'assaig «X. Nom de la mostra» o «X.B»
• Es pipeteja 2 ml de la mostra/blanc i els avoquem en el seu tub d'assaig corresponent.
• S'afegeix 1mL d'àcid nítric amb una pipeta de vidre.
• A continuació s'escalfa aigua (pot ser de l'aixeta) una placa calefactora (per accelerar el procés és pot col·locar un vidre de rellotge en la boca del bas).
• Quan l'aigua ja està bullint s'introdueix els tubs d'assaig al bas de precipitats amb aigua calenta (la placa ha d'estar apagada) durant uns 30'.
• S'extreuen els tubs d'assaig i els col·loquem amb un altre bas amb aigua freda per refredar.
• Quan ja estiguin els tubs a temperatura ambiental afegir 1mL de NaOH a la mostra/blanc.
• Anotar i ordenar els resultats obtinguts a partir de més taronjós a menys.

Prova del biuret

• S'etiqueten quatre tubs d'assaig «B. Nom de la mostra» o «B.B»
• Es pipeteja 2mL de la mostra/blanc al tub d'assaig i els avoquem en el seu tub d'assaig corresponent.
• Es pipeteja 5mL de NaOH i s'aboca en el tub.
• A continuació s'introdueix un parell de gotes (fins notar una coloració nítida) de Cu2SO3
• Anotar i ordenar els resultats obtinguts a partir de més lila a blau.

Desnaturalització

• Marcar 12 tubs d'assaig amb números.
• Pipetejar 2mL de la mostra i abocar en 4 tubs d'assaig per mostra.
• Pipetejar 2mL de NaOH i abocar en els tubs d'assaig 1, 5 i 9.
• Pipetejar 2mL de HCl i abocar en els tubs d'assaig 2, 6 i 10.
• Pipetejar 2mL de NaCl i abocar en els tubs d'assaig 3, 7 i 11.
• Escalfeu moderadament sense introduir re els tubs d'assaig 4,8 i 12
• Anoteu els resultats i ordenar per ordre de coagulació de proteïnes.

Càlculs

Càlculs de les dissolucions dels reactius

NaOH 40%
Cu2(SO4)3
H2NO3
HCl
NaCl

Dades

Enregistrament de les dades

	Reacció xantoproteïca	Prova biuret
Llet de vaca	+	+
Clara d'ou	+	+
Llet de soja	+	+
Blanc	-	-

Observacions:

Els resultats obtinguts en les mostres presenten graus: 1r Clara d'ou, 2n Llet de soja i 3r llet de vaca.

Determinació de les proteïnes.3

Determinació quantitativa de proteïnes

Procediment

Realització de patrons

Les mesures exactes estan en l'apartat «Càlculs per fer les dissolucions patró»

Dilució de mostra

• S'etiqueten tres tubs d'assaig amb els noms de les mostres.
• Es dissolen les mostres de llet a 1:50.
  • Es pipeteja 5 ml de PBS i s'aboca en cada un dels tubs d'assaig.
  • En cada tub de mostra de llet s'aboca 1mL de la mostra corresponent.
• Es dissol la mostra de clara d'ou a 1:125.
  • Es pipeteja 12,5mL de PBS i s'aboca en el tub d'assaig.
  • Introduir la mostra en un Eppendorf.
  • Es pipeteja 100µL de la mostra i s'aboca en el tub d'assaig.

Preparació de dissolucions l'espectrofotòmetre

• S'etiqueta les cubetes depenent del contingut que s'abocara (patró, PBS o mostra).
• Es pipeteja 20 µL de la dissolució i s'aboca en la cubeta corresponent.
• Es pipeteja 1mL de Bradford i s'aboca en la cubeta.
• Tapa amb para-film les cubetes i deixar que s'incubi durant 10' a temperatura ambiental.

Funcionament d'espectrofotòmetre

• Endollar a la corrent i encendre l'equip.
• Púlsar el boto «PROTEÏNA»
• Púlsar el boto «SELECT» per escollir el tipus d'assaig, seleccionar «BRADFORD» i pressionar «ENTER».
• En la pantalla surt «VOLS EXTREURE LA LECTURA DE FONS? » polsar «NO» i pressionar «ENTER».
• En la pantalla surt «VOLS FER UNA NOVA CORBA ESTÀNDARD? » polsar «SI» i pressionar «ENTER».

• Selecciona 1 per-programar el mètode pel nombre de repeticions i a continuació pressionar «ENTER».
• Introduir en la cambra la cubeta del blanc i púlsar el boto «seleccionar blanc».
• Introduir 4 pel numero de patrons per la corba, utilitzant el teclat numèric i pressionar «ENTER».
• Establir les unitats de concentració, seleccionar «mg/ml» i pressionar «ENTER».
• Introduir 1 (nombre de rèpliques que s’han llegit), seleccionar «NO» i pressionar «ENTER».
• Introduir la concentració del primer patró utilitzant el teclat numèric «PATRÓ (1) 0,125» i pressionar «ENTER».
• Llegir el valor de l’absorbància pel patró 1, col·locar la cubeta a la cambra i pressionar “LLEGIR LA MOSTRA».
• Repetir aquest procediment per a tots els patrons.
• La pantalla ens diu «DESITGA MODIFICAR LA CORBA ESTÀNDARD? », seleccionar «NO» i pressionar «ENTER».
• Desar la corba estàndard i proporcionar un nom a la corba.
• Seleccionar per no llegir rèplica «NO» i pressionar «ENTER».
• Sortir de l’assaig prement la tecla ◄ i ens apareix a la pantalla «IMPRIMIR TOT EL RESULTAT? » seleccionar «SI» i pressionar «ENTER».

Lectura de les mostres: primer el blanc i després les mostres

• Pressionar el botó «PROTEÏNA».
• Seleccionar assaig Bradford. A la pantalla apareix «RESTAR LECTURA DE FONS?» seleccionar «NO».
• A la pantalla apareix «TRAÇAR LA NOVA CORBA?» seleccionar «NO".
• Desprès enes diu «RECUPERAR CORBA?» seleccionar «SI». Escollim la corba guardada.
• A la pantalla apareix «INFORME DE LA CORBA?» seleccionar «NO».
• Situar la cubeta del blanc i prémer «LLEGIR BLANC».
• Desprès cal situar la mostra 1 a la cubeta i pressionar «LLEGIR MOSTRA » i així fins acabar amb totes les mostres.

DADES

Dades de l'etiqueta de les mostres

Mostra	Concentració	Dissolució
Llet d'ovella	5,4g/100mL	1:50
Llet de soja	3,6g/100mL	1:50
Clara d'ou	110mg/mg→1,0357mg/mL	1:125

Dades obtingudes en l'espectrofotòmetre

Nom	Concentració (mg/mL)	Absorbància
Patrons	0,125	0,041
	0,5	0,059
	1	0,390
	2	0,735
Llet d'ovella	1,5572	0,574
	1,5511	0,571
	1,5546	0,573
Llet de soja	0,7316	0,234
	0,7395	0,238
	0,7409	0,238
Clara d'ou	8,9201	3,602
	8,8597	3,577
	9,3791	3,791
	8,2857	3,341

Diagrama d'absorbància-concentració del patró amb línia de tendència

CÀLCULS

Càlculs per fer les dissolucions patró

Càlculs estadístics

Càlculs de la concentració de proteïnes en la mostra a partir de la nova mitjana i la línia de tendència

Llet d'ovella
Llet de soja
Clara d'ou

Error relatiu respecte el valor de l'etiqueta i el valor experimental

Llet d'ovella	Llet de soja	Clara d'ou